dna测序

DNA测序有哪些方法？

第1 代测序技术
荧光标记的Sanger 法—— 在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。用于测序的技术主要有Sanger（1977）发明的双脱氧核糖核酸链末端终止法，Sanger测序法得到了广泛的应用。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。 Sanger法测序的原理就是，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
第2 代测序技术
循环阵列合成测序法—— 述第2 代测序技术中, 序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下, 通过读取DNA 聚合酶或DNA 连接酶将碱基连接到DNA 链上过程中释放出的光学信号而间接确定的. 除了需要昂贵的光学监测系统, 还要记录、存储并分析大量的光学图像.这都使仪器的复杂性和成本增加. 依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用, 在测序成本中比例相当大. 直接读取序列信息, 不使用化学试剂, 对于进一步降低测序成本是非常可取的.在一个正在发生突破瓶颈巨变的领域内, 很难准确预测未来将发生什么.
第3 代测序技术
直接测序——将基因组DNA 随机切割成大约100 kb 左右的片段,制成单链并与六寡聚核苷酸探针杂交. 然后驱动结合了探针的基因组文库片段通过可寻址的纳米孔阵列. 通过每个孔的离子电流均可独立测量. 追踪电流的变化确定探针杂交在每个基因组片段上的精确位置. 利用基因组片段上杂交探针的重叠区域将基因组片段文库排列起来, 建立一组完整的基因组探针

[create_time]2022-10-24 17:01:23[/create_time]2022-10-27 11:58:14[finished_time]1[reply_count]0[alue_good]cj020316cqms[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/wise.1.29d7129c.ZirQ4JMIotynm4Fs_eRFNg.jpg?time=8482&tieba_portrait_time=8482[avatar][slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]371[view_count]

测序小知识之名词解释

1、Read depth Read深度：一个样本测序得到的reads数；容易和基因组测序的覆盖度 (多少基因组区域被测到了)和测序深度混淆 (单个核苷酸被测到的次数或所有核苷酸被测到的平均深度)。

2、Short-read 短读长：测序得到的长度最大是500 bp的reads，常见的测序片段长度为100-300 bp；本文中的短读长测序片段代表测到的mRNA片段和降解了的mRNA。

3、Long-read 长读长：测序得到的超过1000 bp的reads，本文中代表全长或近乎全长的mRNA。

4、Direct RNA sequencing (dRNA-seq): 直接测序RNA而非cDNA的测序技术，通常用于测序全长或近全长的mRNA 。

5、Multi-mapped reads 多重比对的reads：从转录组同源区域测序得到的reads，不能精确确认其转录本或基因组的来源。

6、Synthetic long reads 合成long reads：通过组装多个短读长得到长读长的方法。

7、唯一分子标识符（UMIs）：在扩增前，构建RNA-seq文库的时候加入的短序列或barcodes，理想情况下每条转录本结合一个唯一的标识符，含有此标识符的reads都来源于此转录本，定量时只计算一次。可以用来降低RNA-seq的定量偏好性，在RNA起始量低的单细胞实验中尤为适用。

8、Read length 读长：单个测序reads的长度，short-read RNA测序得到的长度通常是50-150 bp。

9、Sensitivity 敏感性：样本中多大比例的转录本会被测到，敏感性越高，这一比例越高。它受样本处理、文库制备、测序和计算偏好性的影响。

10、Specificity 特异性：度量差异表达转录本被正确鉴定出的比例的方法，它受样本处理，文库制备，测序和计算偏好性的影响。

11、Duplication rates 重复Reads比率：比对到转录组相同位置的的测序reads的比例。在RNA-seq文库中，一些转录本可能有高的重复率，因为它们在样本中表达水平高。高表达的基因的重复率很高，而低表达基因的或许有着最小的重复率。由此RNA-seq面临着一个挑战，该技术中大部分重复可能是高表达转录本带来的真实信号，而另一些则是由于扩增和测序偏好性造成的。

12、Single-end sequencing 单端测序 (SE)：只测序cDNA片段的一端，因其费用低，常用于只关注差异基因表达的项目中。（NGS基础 - 高通量测序原理）

13、Paired-end sequencing 双端测序 (PE)：cDNA片段两端分别测序，可以测序到cDNA的更多碱基，更好的识别剪接位点，常于差异基因表达分析项目。

14、生物学重复：对生物来源不同的样本的多次检测，比如来自三个个体的组织，用于捕获生物个体自身的变化；这个变化要么是待研究的对象，要么是噪音。相较之下，技术重复是对同样的样本做重复的操作—比如，对一个组织做三次处理。

15、Expression matrix 表达矩阵：差异表达RNA-seq项目的核心数据文件。每一行代表一个RNA，比如基因或者转录本。每一列是一个测序的样本。矩阵中的数值是每个RNA的reads数。这些可能是对转录异构体的计数估计，并通常在后续的分析前先进行标准化转化。

16、Spike-in control 内参：按特定浓度添加到样品中的外源核酸库。它们通常是预先合成的不同浓度的RNA，用于监测反应效率和技术方法的偏差和假阴性结果。

17、Spatialomics 空间转录组学：能保留给定样本（通常是组织切片）中每个转录本的空间信息的转录组分析方法。

18、Nascent RNA 新生RNA：刚刚转录出来的RNA，与已经加工并运输到细胞质的RNA相对应。

19、Translatome 翻译组：细胞、组织或生物体中正在翻译成蛋白质的mRNA集合。

20、Structurome 结构组：细胞、组织或生物体中RNA的二级和三级结构集合。

21、Interactome 互作组：细胞、组织和生物体中分子相互作用的集合，包括有RNA-RNA或者RNA-蛋白质的相互作用。

22、Differential gene expression (DGE) 差异基因：两个实验组中表达显著变化的基因

[create_time]2022-07-12 02:56:10[/create_time]2022-07-23 13:44:14[finished_time]1[reply_count]0[alue_good]清宁时光17[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/wise.1.f66817d0.sg2uptlA4rVTuV_qaAgZJw.jpg?time=582&tieba_portrait_time=582[avatar]TA获得超过1.1万个赞[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]27[view_count]

测序常用名词的解释整理

　　高通量测序技术（High-throughputsequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变,一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定,因此在有些文献中称其为下一代测序技术(nextgenerationsequencing，NGS)足见其划时代的改变,同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,所以又被称为深度测序(Deepsequencing)。什么是Sanger法测序（一代测序）

　　Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

　　什么是基因组重测序（GenomeRe-sequencing）

　　全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。

　　什么是denovo测序

　　denovo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。

　　测序名词关系图

　　什么是fragments

　　fragments就是打成的片段，而测序测的就是这些fragments，测出来的结果就是reads，又可以分为单端侧和双端侧，单端测序的话，只是从fragments的一端测序，测多长read就多长，双端测序就是从一个fragments的两端测，就会得出两个reads

　　什么是Reads

　　高通量测序平台产生的序列就称为reads。

　　(测序读到的碱基序列片段，测序的最小单位；)

　　什么是Contig

　　拼接软件基于reads之间的overlap区，拼接获得的序列称为Contig（重叠群）。(由reads通过对overlap区域拼接组装成的没有gap的序列段；)

　　什么是ContigN50

　　Reads拼接后会获得一些不同长度的Contigs。将所有的Contig长度相加，能获得一个Contig总长度。然后将所有的'Contigs按照从长到短进行排序，如获得Contig1，Contig2，Contig3...???Contig25。将Contig按照这个顺序依次相加，当相加的长度达到Contig总长度的一半时，最后一个加上的Contig长度即为ContigN50。举例：Contig1+Contig2+Contig3+Contig4=Contig

　　总长度*1/2时，Contig4的长度即为ContigN50。ContigN50可以作为基因组拼接的结果好坏的一个判断标准。

　　什么是Scaffold

　　基因组denovo测序（没有参考基因组的测序，需要研究人员从头拼接得到的序列），通过reads拼接获得Contigs后，往往还需要构建454Paired-end库或IlluminaMate-pair库，以获得一定大小片段（如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）两端的序列。基于这些序列，可以确定一些Contig之间的顺序关系，这些先后顺序已知的Contigs组成Scaffold。

　　(通过pairends信息确定出的contig排列，中间有gap)

　　什么是ScaffoldN50

　　ScaffoldN50与ContigN50的定义类似。Contigs拼接组装获得一些不同长度的Scaffolds。将所有的Scaffold长度相加，能获得一个Scaffold总长度。然后将所有的Scaffolds按照从长到短进行排序，如获得Scaffold1，Scaffold2，Scaffold3...???Scaffold25。将Scaffold按照这个顺序依次相加，当相加的长度达到Scaffold总长度的一半时，最后一个加上的Scaffold长度即为ScaffoldN50。举例：Scaffold1+Scaffold2+Scaffold3+Scaffold4+Scaffold5=Scaffold总长度*1/2时，Scaffold5的长度即为ScaffoldN50。ScaffoldN50可以作为基因组拼接的结果好坏的一个判断标准。

　　什么是测序深度和覆盖度

　　测序深度：是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。假设一个基因大小为2M，测序深度为10X，那么获得的总数据量为20M。

　　覆盖度：是指测序获得的序列占整个基因组的比例。

　　Gap：由于基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖有所的区域，这部分没有获得的区域就称为。例如一个细菌基因组测序，覆盖度是98%，那么还有2%的序列区域是没有通过测序获得的。

　　什么是RPKM、FPKM

　　RPKM,ReadsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads,isdefinedinthisway[Mortazavietal.,2008]:

　　每1百万个map上的reads中map到外显子的每1K个碱基上的reads个数。假如有1百万个reads映射到了人的基因组上，那么具体到每个外显子呢，有多少映射上了呢，而外显子的长度不一，那么每1K个碱基上又有多少reads映射上了呢，这大概就是这个RPKM的直观解释。

　　如果对应特定基因的话，那么就是每1000000mapped到该基因上的reads中每kb有多少是mapped到该基因上的exon的read

[create_time]2022-07-27 08:01:35[/create_time]2022-08-05 12:22:28[finished_time]1[reply_count]0[alue_good]温屿17[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/wise.1.f2ab3c6b.EGWNOK5JoOudI3wwHvt0TA.jpg?time=4578&tieba_portrait_time=4578[avatar]TA获得超过9698个赞[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]16[view_count]

解释Sanger的DNA测序法的方法学原理?

【答案】：DNA的Sanger测序法用了两个基本原则：(1)核酸聚合方向是5'→3'，取决于模板(DNA聚合酶的使用包括细菌的修补DNA合成)；(2)可延伸引物必须提供3'-OH末端，因双脱氧核糖核苷酸缺乏自由的3'-OH，会终止聚合反应，这产生了不同长度的四组DNA片段，所有长度的比较可确定核苷酸的顺序。

[create_time]2023-04-17 08:13:07[/create_time]2023-05-02 07:58:02[finished_time]1[reply_count]0[alue_good]考试资料网[uname]https://pic.rmb.bdstatic.com/a1a6b96a94de8451994b608ca7e87353.jpeg[avatar]百度认证:赞题库官方账号[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]11[view_count]

染色体基因芯片分析和第二代测序应用的区别

染色体基因芯片分析和第二代测序应用的区别如下：染色体基因芯片是将基因片段有序地固定在玻璃载体上，用荧光标记的被检测者的DNA片段与之杂交，将结果扫描、软件提取并分析数据的一种快速、高效的分子生物学分析手段。基因测序是确定一条染色体片断上的碱基排列的顺序。二代测序为高通量测序，采用微珠或高密度芯片边合成边测序，代表有454，solexa，solid，高通量，可一次获得数G数据，相对与第三代，都仍然需要扩增的方法放大信号，扩增后再检测。染色体基因芯片具有高通量（一次动作可以完成实验室多个步骤的工作）、高信息量（一张芯片可以完成多种基因的检测）、快速灵敏、样品用量少、成本相对低廉等优点。第二代测序检测在对已发生疾病（临床）检出率方面略优于基因芯片，但却非常的费时、费力。更多关于染色体基因芯片分析和第二代测序应用的信息，推荐咨询海普洛斯。海普洛斯在基因测序、液体活检、生物信息和大数据等领域具有独创技术和核心优势，已为全国500多家三甲医院、数百家科研院所、体检机构、保险公司、互联网平台以及各地政府提供基因检测技术服务和整体解决方案。【● 没病有必要做基因检测吗？过来人有话说......】

[create_time]2021-12-14 13:57:54[/create_time]2016-07-03 23:45:11[finished_time]2[reply_count]1[alue_good]海普洛斯[uname]https://pic.rmb.bdstatic.com/bjh/user/5e33b9366e76c1eb1a76bb3138571e09.jpeg[avatar]百度认证:深圳市海普洛斯生物科技有限公司官方账号[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]4526[view_count]

什么是二代测序技术？

二代测序技术又称为高通过量测序技术，是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变。二代测序技术的核心思想是边合成边测序，可以一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，所以又被称深度测序。由于二代测序技术具有多样本、多位点同时进行测序并且具有较高的覆盖率等优势，在生命科学领域已经被广泛应用。

[create_time]2020-07-29 09:21:01[/create_time]2020-08-13 09:18:09[finished_time]2[reply_count]0[alue_good]百度网友4774ecb[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/wise.1.10d326ea.ugiC6rskzuaZ-GC6VMsu0A.jpg?time=9994&tieba_portrait_time=9994[avatar]超过13用户采纳过TA的回答[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]479[view_count]

什么是脱氧核糖核酸测序

脱氧核糖核酸测序即DNA测序（DNAsequencing）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。

测序原理：

1、化学修饰法测序原理

化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离。

2、Sanger法测序的原理

就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种dNTP，并混入限量的一种不同的ddNTP。

[create_time]2023-02-18 10:38:17[/create_time]2023-02-27 00:37:03[finished_time]1[reply_count]0[alue_good]吃饺子不加醋2333[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/wise.1.513b5d1b.li7UQboFW9KhRa9y65aBDg.jpg?time=6722&tieba_portrait_time=6722[avatar]TA获得超过408个赞[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]34[view_count]

什么是脱氧核糖核酸测序

脱氧核糖核酸测序即DNA测序（DNAsequencing）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。

测序原理：

1、化学修饰法测序原理

化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离。

2、Sanger法测序的原理

就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种dNTP，并混入限量的一种不同的ddNTP。

[create_time]2022-10-21 22:30:10[/create_time]2022-11-05 05:58:05[finished_time]1[reply_count]0[alue_good]一袭可爱风1718[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/wise.1.5395ef26.n9N8duaooP2iWjvaRSNI0A.jpg?time=4591&tieba_portrait_time=4591[avatar]TA获得超过9961个赞[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]72[view_count]

一代测序和二代测序的区别是什么?

一、含义不同：第一代测序：指双脱氧末端终止法，扩增后通过毛细管电泳读取序列，每次获取数据量少。第二代测序：为高通量测序，采用微珠或高密度芯片边合成边测序，代表有454，solexa，solid，高通量，可一次获得数G数据，相对与第三代，都仍然需要扩增的方法放大信号，扩增后再检测。二、作用不同：Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。普通的二代测序，全基因组或外显子组测序是将DNA分成小片段，然后对各个片段多次读取（一般是三十次）。然而，如果突变只发生在15-20%的细胞中，三十次读取还不足以可靠地捕捉到它们，尤其是当突变只影响一个基因拷贝时。测序程序在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP（包括放射性标记的dNTP，例如32PdNTP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP（双脱氧核苷酸）。与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理）结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。以上内容参考：百度百科-双脱氧链终止法

[create_time]2021-05-10 16:57:24[/create_time]2021-05-22 00:00:00[finished_time]2[reply_count]7[alue_good]帐号已注销[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/wise.1.a23e5509.D47I0Sno_yughyYmTg9Qiw.jpg?time=3415&tieba_portrait_time=3415[avatar]TA获得超过76.7万个赞[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]21688[view_count]

新一代测序中，基因从头测序和重测序有什么区别

基因从头测序也叫做基因de
novo测序，是指不依赖于任何已知基因组序列信息对某个物种的基因组进行测序，然后应用生物信息学手段对测序序列进行拼接和组装，最终获得该物种基因组序列图谱。
重测序是指在已知物种基因组的情况下，对物种内的不同个体或某个个体的不同组织进行基因组重测序，可以在全基因组水平上发现不同个体或组织细胞之间的差异。通过这种方法，可以寻找出大量的单核苷酸多态性位点（snp），插入缺失位点（indel，insertion
deletion），结构变异位点（sv，structure
variation），拷贝数变异（copy
number
variation，cnv）等变异信息，从而获得生物群体的遗传特征。
病毒变异率很高，一般不用重测序，可以用de
novo从头测序。

[create_time]2020-03-08 04:11:29[/create_time]2020-08-25 05:33:28[finished_time]2[reply_count]14[alue_good]宏运莱改祺[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/wise.1.35a4ac87.HVd8tZxefBtgJdqOKPSjSw.jpg?time=10587&tieba_portrait_time=10587[avatar]TA获得超过3万个赞[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]4041[view_count]

基因测序的步骤是什么?

PCR产物直接测序技术现已成为分子生物学和基因组学研究中的一个重要技术,广泛用于基因突变检测、遗传性疾病诊断、单核苷酸多态性研究、基因组重叠序列群等.与传统克隆测序技术相比较,直接对PCR扩增的DNA进行测序,省去了耗时的克隆步骤,避免了传统的细菌培养,模板提取等重复性操作,可以从少量的原始样品中得到正确的DNA序列信息.PCR产物直接测序技术具有快速、简便、稳定经济的优点.
试验试剂
PCR扩增的双链DNA模板
长约20个核苷酸的DNA引物
DNA聚合酶
测序胶
0.1mol/L DDT
α-32P-dATP
dNTP/ddNTP混合物(80μmol/L/8μmol/L)
dNTP(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L)
测序反应缓冲液：40mmol/L Tris-HCl(pH7.5),20mmol/L MgCl2,50mmol/L NaCl
终止缓冲液：95% 甲酰胺,20mmol/L EDTA,0.05% 溴酚蓝,0.05% 二甲苯腈
试验步骤：
1、 4个微量离心管中各加入dNTP/ddNTP混合物2.5μl,混合物37OC温浴5min,备用.
2、 在一个空的微量离心管中加入1pmol的PCR扩增双链DNA,10pmol测序引物,2μl 5×测序缓冲液,加双蒸水至总体积10μl,96OC加热8min,冰浴泠却1min,4OC 10000g离心10s.
3、 加入2μl预冷的标记混合物(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L),α-32P-dATP 5μCi,1μl 0.1mol/L DDT,测序酶2U,加水至15μl,混匀后置冰上2min,标记新合成的DNA链.
4、 在第1步骤的4个管中各加入3.5μl标记反应混合物,37OC温浴5min.每管各加入4μl终止液.
5、 样品在80OC的水浴中热变性5min,每一泳道加2μl 加到测序胶上,电泳分离这些片段.
注意事项：
1.?PCR产物要有一定的长度(>200bp),因为测序结果两端20-30bp的电泳峰图的准确性较低.
2.?纯化PCR产物可通过离子交换层析使扩增的DNA段与反应剩余的dNTP及引物分离；也可通过琼脂糖凝胶电泳,将PCR产物与非特异性扩增产物和引物分离开来；如果扩增的特异性较高时,可直接通过酚：氯仿抽提,乙醇沉淀的方法来纯化.
3.?测序引物设计原则类似于PCR引物设计,可在DNA合成仪上合成20个左右的核苷酸作为引物,经过高压液相层析或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后,即可用作测序引物.
PCR循环测序法
PCR循环测序法是将PCR扩增和核酸序列分析技术相结合,从而形成的一种测定核苷酸序列的研究方法,也称作线性扩增测序.该方法采用PCR仪加热使DNA模板变性,在TaqDNA聚合酶作用下,以温度循环模式在模板上进行多轮的双脱氧核苷酸测序反应,线性扩增标记的DNA分子.
PCR循环测序法与以往的测序方法相比,其优点在于：大大减少所需的模板量；能提高测序反应产生的信号,降低了操作的复杂性,且聚合酶的用量减少；可在小量制备的模板上进行筛选反应；高温下进行的测序反应使DNA聚合酶催化的聚合反应能够通过模板二级结构的区域；双链闭环DNA可以直接作为反应模板应用,不用作预先碱变性处理.由于PCR循环测序法能够简单、快速地检测特定序列,因此, PCR循环测序法在核酸序列分析研究中受到广泛的重视.
试验试剂：
DNA测序试剂盒
dNTP
ddNTP
丙烯酰胺
双丙烯酰胺
尿素
TEMED(N,N,N‘,N’-四甲基乙二胺)
过硫酸铵
6%测序胶：6%丙烯酰胺,7mmol/L 尿素,1×TBE.
10×测序缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(pH8.8),500mmol/L KCl,40mmol/L MgCl2,0.01%明胶,20μmol/L dATP,50μmol/L dCTP,50μmol/L dGTP,50μmol/L dTTP
终止混合液：ddATP (600μmol/L),ddCTP (600μmol/L),ddGTP (100μmol/L),ddTTP(1000μmol/L)
终止缓冲液：95%甲酰胺,20mmol/L EDTA,0.05%溴酚蓝,0.05%二甲苯腈
试验步骤
1、 4个小离心管,每个小管加入3μl的终止混合液,将管子放在冰上.
2、 在DNA模板中加入引物(4pmol), 4μl 10×测序缓冲液, 10μlα-32P-dATP, 2U TaqDNA聚合酶,加双蒸水到30μl彻底混匀,每管7μl加入上面4个小管中.
3、 反应液上加30μl的石蜡油.
4、 95OC 30S,50OC 30S,72OC 60S共30个循环,可根据具体的情况进行适当的调整循环条件及循环次数.
5、 反应结束后在油层下加入5μl的终止缓冲液并用加样枪混匀.
6、 上样前将样品在大于80OC的水浴中热变性5min,每一道加2μl加到测序胶上,电泳分离这些片段.
注意事项：
1、 制备测序模板：PCR 扩增的产物可以经过低熔点的琼脂糖凝胶电泳纯化回收后,用于序列分析；可经过柱层析纯化,去除PCR 反应后剩余的dNTP和引物后,用于序列分析.PCR 产物也可不经纯化直接用于测序,但是这种测序产生的结果较差,建议测序之前应进行PCR产物的纯化.各种标准的质粒制备方法所纯化出的质粒均可作为测序模板使用.用标准方法制备的M13噬菌体、粘粒、λDNA都适合用作测序模板用.但要注意的是反应体系中不应有与引物互补的非目的基因序列,否则将会导致测序实验的失败.
2、 测序引物：测序引物是指合成的与测序模板链特异性互补的寡核苷酸序列.可用α-32P-dATP和T4多聚核苷酸激酶对引物的5‘端进行标记,反应体系中引物、激酶和α-32P-dATP要保持在最佳的比例,以得到高比活性的标记引物；也可用α-32P-dATP标记新合成的DNA链.引物的浓度不宜高,否则容易形成引物二聚体,或产生非特异性的扩增引物.
3、 酶：各种缺乏3‘—5‘端外切活性的耐热DNA聚合酶都可以用于循环测序,其中TaqDNA聚合酶在DNA测序中最为常用.虽然应用PCR循环测序法能够简单、快速的进行基因序列的测定,但仍未能适应大规模DNA序列测定的需要,而PCR循环测序法、荧光标记和自动测序仪的联合使用成为大规模基因组测序的主要技术.该技术是采用荧光标记引物或双脱氧核苷三磷酸,反应产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,经特定的DNA序列分析仪和分析系统处理待测的DNA序列.它的应用减轻了DNA序列测定的工作量,提高了测序的效率.

[create_time]2020-02-24 22:33:07[/create_time]2014-09-03 10:46:10[finished_time]1[reply_count]3[alue_good]及木qz[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/wise.1.d5573fe1.QiAPdejvXKLRG_6-uN-j4w.jpg?time=10704&tieba_portrait_time=10704[avatar]TA获得超过3562个赞[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]2558[view_count]

DNA测序的测序原理是什么？

DNA测序的测序原理是：利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。测序规律：生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因此上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定。在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。

[create_time]2022-08-02 16:08:16[/create_time]2022-08-17 16:08:16[finished_time]1[reply_count]0[alue_good]乾莱信息咨询[uname]https://pic.rmb.bdstatic.com/bjh/user/62ac8245037c35cef5dd05b07789a9ca.jpeg[avatar]百度认证:内蒙古乾莱科技官方账号[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]42[view_count]

全基因组测序有什么意义?

全基因组测序的意义是使人类从根本上认知疾病发生的原因，做到正确的治疗疾病、尽早的预防疾病。每个人从受精卵开始就继承了父母的DNA遗传信息，并且携带一生，不易改变。全基因组测序就是通过运用新一代高通量DNA测序仪，进行10-20倍覆盖率的个人全基因组测序，然后与人类基因组精确图谱比较，得到完整的个人全基因组序列，破译个人全部的遗传信息的过程。测序应用通过生物信息手段，分析不同个体基因组间的结构差异，同时完成SNP及基因组结构注释。 DNA突变可诱发癌症。吸烟过程中所释放的>60种致癌化学物质可与DNA结合并对DNA链上的鸟嘌呤和腺嘌呤进行化学修饰从而产生大的加合物，该加合物改变了DNA双螺旋的结构。如果不被核苷酸剪切修复或其他的途径进行纠正，那么DNA在复制时就会按照non-Watson-Crick方式进行复制并阻止RNA聚合酶进行转录，从而引发癌症。

[create_time]2021-11-13 16:43:22[/create_time]2021-11-21 17:25:43[finished_time]1[reply_count]1[alue_good]帐号已注销[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/wise.1.a23e5509.D47I0Sno_yughyYmTg9Qiw.jpg?time=3415&tieba_portrait_time=3415[avatar]TA获得超过76.7万个赞[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]1781[view_count]

什么是基因二代测序？

即第二代DNA测序技术。第二代测序技术的核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。DNA测序(DNA sequencing)作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构(Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。随后在1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术(Next-generation sequencing)应运而生。这三个技术平台各有优点，454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长(read)能达到400bp;Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10;SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。拓展资料基因测序是一种新型基因检测技术，能够从血液或唾液中分析测定基因全序列，预测罹患多种疾病的可能性，个体的行为特征及行为合理。基因测序技术能锁定个人病变基因，提前预防和治疗。基因测序相关产品和技术已由实验室研究演变到临床使用，可以说基因测序技术，是下一个改变世界的技术参考资料：百度百科基因测序

[create_time]2022-11-16 16:24:33[/create_time]2022-12-01 16:24:33[finished_time]1[reply_count]0[alue_good]信必鑫服务平台[uname]https://himg.bdimg.com/sys/portrait/item/wise.1.3b707489.Pzvh_phCV7cMa9W2PNEYAQ.jpg?time=66&tieba_portrait_time=66[avatar]TA获得超过5.3万个赞[slogan]这个人很懒，什么都没留下![intro]406[view_count]